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| 免疫化学和特定蛋白检测 | |||||
| 免疫化学和特定蛋白检测 | |||||
作者:佚名 文章来源:本站原创 点击数: 更新时间:2007-6-19 ![]() |
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常用的免疫化学技术包括:免疫浊度法、胶乳免疫法、放射免疫法、酶免疫法、发光免疫法、时间分辨荧光免疫法、斑点免疫渗滤法和免疫电泳法,其中以免疫浊度法应用最为普遍。许多特定蛋白分析仪都是以免疫浊度法为设计原理的。 免疫比浊法 免疫法的基本原理是在一定适宜的条件下,液体中特定抗原与其相应的抗体结合后,形成抗原-抗体复合物。这种难溶性的大分子复合物能在液相中产生浊度。然后可以利用外界光源的照射,或者检测溶液透射光减少的程度(免疫透射比浊法),或者检测复合物对光的散射程度(免疫散射比浊法)计算复合物的含量,再推算出溶液中待测抗原或抗体的含量。 透射比浊法(Turbidimetry):根据Lambert-Beer定律,当一束光线通过带有微小粒子的悬浮液和胶体溶液时,此溶液受到光散射和光吸收两个因素影响可使光的强度减弱,减弱的程度与溶液中微小粒子的含量成正比。所以,当光线通过免疫复合物时,由于反应体系中复合物颗粒对光线的反射和吸收,引起透射光减少,测量通过反应体系后的透射光照到光电倍增管的光强度,或者测定反应体系的吸光度,推导出溶液中待测物质的浓度。 散射比浊法(Nephelometry):根据Rayleigh定律,粒子被光照射后而发光,发光的轻度与粒子的大小以及照射光的角度有关。当光线通过免疫复合物时,由于反应体系中复合物颗粒可被光线折射,发生偏转;而这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别;通过测量在入射光的一定角度上复合物颗粒发出的散射光强度,推导出溶液中待测物质的浓度。根据测定方式的不同,散射比浊法又分为速率散射比浊法(Rate nephelometry)和终点散射比浊法(End point nephelometry)。 速率散射比浊法是一种抗原、抗体结合的动态测定法。所谓速率是指抗原——抗体在单位时间内结合的速度。速率法是测定最大反应速率,也就是抗原——抗体反应达到最高峰时形成免疫复合物的量。一般这个时间是几十秒,峰值的高低与待测物质(抗原)的量成正比,而形成峰值的时间与抗体(试剂)的浓度和其与抗原的亲和力有关。 终点散射比浊法是观察抗原和抗体反应达到平衡时,免疫复合物形成的量不再增加,反应体系的浊度不再变化,测定此时的溶液浊度。一般这个过程需要几十分钟,复合物的浓度不再受时间变化的影响,应当说是免疫反应的结束,但又不能出现絮状沉淀影响浊度的判断。 为了提高检测的灵敏度,就需要为抗原——抗体的结合创造条件。因此,人们采用一种带有载体的免疫比浊方法,即选择一种大小适中、均匀一致的胶乳颗粒,吸附上抗体(试剂)后,大大增加了抗原——抗体的接触机会,当遇到特异性抗原便可发生凝集。单个胶乳颗粒可允许光线通过,而两个胶乳颗粒凝集后,则使光线通过减少,减少的程度与胶乳颗粒凝集成正比,当然也就和带测抗原成正比。 特定蛋白分析仪 免疫法可能受到伪浊度的干扰,产生伪浊度的原因主要有:(1)抗体(试剂)的质量,如试剂中含有非特异性的交叉反应性抗体、试剂被污染或变质。(2)试剂中添加的增浊剂浓度过高。(3)反应时间掌握不当,如速率法反应时间过长,终点法时出现絮状沉淀。(4)样品处理不当,如发生溶血。(5)比色杯质量不合格或长久使用清洁度下降。 为了克服以上问题,许多自动化的特定蛋白分析仪都进行了如下改进。 |
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