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[推荐]免疫化学和特定蛋白检测           ★★★ 【字体:
免疫化学和特定蛋白检测
免疫化学和特定蛋白检测
作者:佚名    文章来源:本站原创    点击数:    更新时间:2007-6-19    
免疫化学是免疫学技术和生物化学技术的结合,它既具有免疫学抗原抗体结合的特异性,又具有生物化学反应动力学特点,可以在自动化生化分析仪上检测体液,特别是血液中微量生物化学物质,是一种非常有应用前途的临床检验实用技术。根据免疫化学的基本原理而研制、开发的各种特定蛋白检测仪器已经广泛地应用在临床检验中,发挥越来越多的作用。

    常用的免疫化学技术包括:免疫浊度法、胶乳免疫法、放射免疫法、酶免疫法、发光免疫法、时间分辨荧光免疫法、斑点免疫渗滤法和免疫电泳法,其中以免疫浊度法应用最为普遍。许多特定蛋白分析仪都是以免疫浊度法为设计原理的。

    免疫比浊法

    免疫法的基本原理是在一定适宜的条件下,液体中特定抗原与其相应的抗体结合后,形成抗原-抗体复合物。这种难溶性的大分子复合物能在液相中产生浊度。然后可以利用外界光源的照射,或者检测溶液透射光减少的程度(免疫透射比浊法),或者检测复合物对光的散射程度(免疫散射比浊法)计算复合物的含量,再推算出溶液中待测抗原或抗体的含量。

    透射比浊法(Turbidimetry):根据Lambert-Beer定律,当一束光线通过带有微小粒子的悬浮液和胶体溶液时,此溶液受到光散射和光吸收两个因素影响可使光的强度减弱,减弱的程度与溶液中微小粒子的含量成正比。所以,当光线通过免疫复合物时,由于反应体系中复合物颗粒对光线的反射和吸收,引起透射光减少,测量通过反应体系后的透射光照到光电倍增管的光强度,或者测定反应体系的吸光度,推导出溶液中待测物质的浓度。

    散射比浊法(Nephelometry):根据Rayleigh定律,粒子被光照射后而发光,发光的轻度与粒子的大小以及照射光的角度有关。当光线通过免疫复合物时,由于反应体系中复合物颗粒可被光线折射,发生偏转;而这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别;通过测量在入射光的一定角度上复合物颗粒发出的散射光强度,推导出溶液中待测物质的浓度。根据测定方式的不同,散射比浊法又分为速率散射比浊法(Rate nephelometry)和终点散射比浊法(End point nephelometry)。

    速率散射比浊法是一种抗原、抗体结合的动态测定法。所谓速率是指抗原——抗体在单位时间内结合的速度。速率法是测定最大反应速率,也就是抗原——抗体反应达到最高峰时形成免疫复合物的量。一般这个时间是几十秒,峰值的高低与待测物质(抗原)的量成正比,而形成峰值的时间与抗体(试剂)的浓度和其与抗原的亲和力有关。

    终点散射比浊法是观察抗原和抗体反应达到平衡时,免疫复合物形成的量不再增加,反应体系的浊度不再变化,测定此时的溶液浊度。一般这个过程需要几十分钟,复合物的浓度不再受时间变化的影响,应当说是免疫反应的结束,但又不能出现絮状沉淀影响浊度的判断。

    为了提高检测的灵敏度,就需要为抗原——抗体的结合创造条件。因此,人们采用一种带有载体的免疫比浊方法,即选择一种大小适中、均匀一致的胶乳颗粒,吸附上抗体(试剂)后,大大增加了抗原——抗体的接触机会,当遇到特异性抗原便可发生凝集。单个胶乳颗粒可允许光线通过,而两个胶乳颗粒凝集后,则使光线通过减少,减少的程度与胶乳颗粒凝集成正比,当然也就和带测抗原成正比。

    特定蛋白分析仪

    免疫法可能受到伪浊度的干扰,产生伪浊度的原因主要有:(1)抗体(试剂)的质量,如试剂中含有非特异性的交叉反应性抗体、试剂被污染或变质。(2)试剂中添加的增浊剂浓度过高。(3)反应时间掌握不当,如速率法反应时间过长,终点法时出现絮状沉淀。(4)样品处理不当,如发生溶血。(5)比色杯质量不合格或长久使用清洁度下降。

    为了克服以上问题,许多自动化的特定蛋白分析仪都进行了如下改进。

    (1)增加了速率信号的获取的性能

    散射免疫比浊法反应的时间曲线中。第一部分的光信号是反应缓冲液本身产生的,可以看作是本底;第二部分是加入标本后(适当稀释的抗原)出现的略微增强的光信号;第三部分才是加入试剂(抗体)后,抗原——抗体反应逐渐增强、光信号也相应增强的曲线,直到反应进行到终点。如果在测定过程中,仪器在反应开始前检测就超出规定阈值的速率峰值,抗体加样针在电脑的控制下推迟工作,等待速率信号回到基线并保持稳定后再加入抗体(试剂)启动反应。如果干扰速率峰持续存在,仪器将给出“标本不稳定”或“反应不稳定”的信号,以提示操作者进行纠正。即使正常的反应程序建立后,仪器还可以通过峰值鉴定程序再对此峰值进行确认,以排除因污染颗粒、气泡及非特异性沉淀物引起的干扰性散射光信号。

    (2)抗原过剩的监测性能

    通常在免疫反应体系中,当抗体量一定的情况下,免疫复合物生成量随着抗原量的增加而增加。但当抗原量超过一定阈值后,免疫复合物的量却随之减少。因此,两份抗原含量根本不同的标本,其测定结果可能是相同的。为了避免这种错误,同时也为避免抗原量太高引起的钩状效应,有的特定蛋白分析仪设置了检查抗原过量的程序。如果反应体系中有游离的抗体(试剂足够)存在,再次加入抗原(待测标本)可出现新的速率峰值信号。如果反应体系中已经没有游离抗体的存在,也就是抗原过剩了,就不会有或者只有很小的速率峰值信号出现。在抗体(试剂足够)过剩的情况下,仪器将确认第一次出现的速率有效,并发出报告;而在抗原(待测标本)过剩的情况下,仪器重新对标本进行更高稀释,然后再测定结果。例如ARRAY 360系统的仪器可对标本自动进行1:6、1:36、1:216和1:1296等稀释度稀释,也可以根据需要临时设定稀释度。


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